Beides kann mit HABA (Buffer R) leicht überprüft werden. HABA hat in Lösung eine gelbe Farbe und bindet an die Biotin-Bindungstasche von Strep-Tactin® bzw. Strep-Tactin®XT. Infolgedessen ändert es seine Farbe zu rot im Falle von Strep-Tactin® bzw. zu orange im Falle von Strep-Tactin®XT. Solange dieser Farbumschlag beobachtet wird, kann die Säule wieder verwendet werden. Anschließend kann das HABA einfach mit 100 mM NaOH abgewaschen werden.

Sehen Sie sich hier unsere Tutorials zur farbbasierten Funktionskontrolle an:

Strep-Tactin®XT 4Flow®

Um hohe Proteinkonzentrationen in einer Fraktion zu erhalten, geben Sie 0,6 CV Puffer BXT als Elutionsfraktion 1 (E1), dann 1,6 CV (E2) und schließlich 0,8 CV (E3) hinzu. Die größte Proteinkonzentration sollte in E2 liegen.

Biotin ist ein häufiger Bestandteil von Zellkulturmedien. Freies Biotin bindet an Strep-Tactin® und inaktiviert folglich die Resins. Es muss vor der Affinitätschromatographie entfernt oder maskiert werden. Hierfür empfehlen wir unsere gebrauchsfertige Biotin-Blockierlösung (BioLock) oder Avidin. Die benötigte Menge an Blocking Solution kann hier überprüft werden.

Bitte sehen Sie sich unsereListe der kompatiblen Reagenzien für Strep-Tactin®XT an.

Bitte sehen Sie sich unsere Liste kompatibler Reagenzien für Strep-Tactin® an.

Ja. Bitte beachten Sie, dass Biotin zugesetzt werden muss, um die biotinylierten Proteine aus dem Resin freizusetzen. Da es irreversibel an das Resin bindet, kann dieses nicht regeneriert werden. Desthiobiotin ist nicht anwendbar, da es biotinylierte Proteine nicht aus dem Resin verdrängt.

Strep-tag®II und Twin-Strep-tag® beeinträchtigen in der Regel weder die Faltung noch die Bioaktivität des rekombinanten Proteins. Wenn der Tag jedoch entfernt werden muss, empfehlen wir die Verwendung der TEV-Protease.

Nein, Desthiobiotin bindet nicht an das Zielprotein. Desthiobiotin kann durch Gelfiltration oder Dialyse aus dem Eluat entfernt werden.

Nein, Biotin bindet nicht an das Zielprotein. Biotin kann durch Gelfiltration oder Dialyse aus dem Eluat entfernt werden.

Packen einer Gravity-flow Säule Video-Tutorial

Bei einer 1-ml-Säule gehen Sie bitte wie folgt vor:

• Nehmen Sie Ihre Säule und schließen Sie die untere Kappe. Schwenken Sie das Resin (50%ige Suspension), bis eine homogene Suspension entsteht.
• Füllen Sie dann die Säule mit 2 ml Resin (das entspricht 1 ml Bettvolumen). Fügen Sie 2 Säulenbettvolumina (CV) Puffer W hinzu und resuspendieren Sie Ihr Resin durch Rühren mit einem kleinen Spatel, um Luftblasen zu vermeiden, die Ihre Durchflussrate verringern könnten.
• Lassen Sie das Resin mindestens 30 Minuten lang absetzen. Befeuchten Sie die obere Fritte mit 1x Buffer W.
  
• Setzen Sie die befeuchtete obere Fritte vorsichtig auf das Säulenbett, indem Sie die Fritte langsam mit der Rückseite einer Pasteurpipette drücken. Achten Sie darauf, dass das Resin nicht zusammengedrückt wird. Waschen Sie Ihr Resin anschließend mit 2 CV Puffer W.
• Optional: Die Position der oberen Fritte überprüfen und gegebenenfalls nachjustieren.

Unsere Puffer enthalten EDTA als antimikrobielles Mittel. Die Puffer funktionieren auch ohne EDTA, und Sie können sie selbst ohne EDTA herstellen.

Biotin kann durch Gelfiltration oder Dialyse entfernt werden.

Desthiobiotin kann durch Gelfiltration oder Dialyse entfernt werden.

Wenn die Säule aus der Kühlung an den Arbeitsplatz gebracht wird, können die erhöhten Temperaturen zu kleinen Luftblasen in der Säule führen. Der Grund dafür ist, dass die Puffer bei niedrigeren Temperaturen mehr Gas aufnehmen können als bei Raumtemperatur. Um Blasen zu vermeiden, arbeiten Sie im Kühlraum weiter, verwenden Sie entgaste Puffer oder waschen Sie die Säule mit Puffern, die bei Raumtemperatur äquilibriert sind, unmittelbar nachdem sie an den Arbeitsplatz gebracht wurde.

Freies Biotin inaktiviert die Strep-Tactin® Resins und muss vor der Affinitätschromatographie entfernt oder maskiert werden. Der einfachste Weg, Biotin vor der Aufreinigung zu entfernen, ist die Zugabe der Avidin-haltigen Biotin-Blockierlösung BioLock. Avidin bindet sowohl an Biotin als auch an biotinylierte Proteine und verhindert so deren Bindung an das Strep-Tactin® Resin.

Sowohl Strep-Tactin® als auch Strep-Tactin®XT haben ein Molekulargewicht von 52 kDa. Beide sind Tetramere und jede Untereinheit hat ein Molekulargewicht von 13 kDa.

Es ist normal, dass die Flussgeschwindigkeit zwischen Säulen variiert. Wenn das Lysat nicht geklärt oder zu zähflüssig ist, kann die Säule verstopfen. Sie können versuchen, den Überstand bei höherer Geschwindigkeit (18.000 x g, 5 Minuten, 4 °C) zu zentrifugieren und das Lysat mit Spritzenfiltern (Porengröße: 0,2 - 0,45 µm) direkt vor dem Auftragen auf die Säule zu filtrieren. Ist das Lysat sehr zähflüssig, wird die Anwendung von RNase A und DNase I empfohlen.

Um große Probenmengen auf eine Gravity-flow-Säule mit kontinuierlichem Durchfluss aufzutragen, wird der WET FRED-Applikator empfohlen. Dieses Gerät arbeitet mit hydrostatischem Druck (Siphonprinzip). Aufgrund seiner geringen Größe und Flexibilität lässt es sich leicht auf dem Arbeitstisch, im Kühlraum oder im Kühlschrank handhaben. Die Säulen können nicht trocken laufen und müssen nicht überwacht werden. Außerdem ist keine komplizierte Software erforderlich, was die Einrichtung und Verwendung erleichtert.

In den Video-Tutorials sehen Sie, wie der Wet Fred aufgebaut und nach der Verwendung gereinigt wird.

1. Der pH-Wert könnte falsch sein. Der pH-Wert sollte bei Strep-Tactin®XT 4Flow® Resin zwischen 4 und 10 liegen.
2. Der Strep-tag®II oder Twin-Strep-tag® ist nicht vorhanden oder wurde abgespalten: Verwenden Sie E. coli-Expressionsstämme mit niedriger Proteaseaktivität oder geben Sie während der Zelllyse Proteaseinhibitoren zu, um den Abbau des Tags zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass der Tag nicht mit einem Teil des Proteins assoziiert ist, der prozessiert wird.
3. Wenn Strep-tag®II oder Twin-Strep-tag® nicht zugänglich sind, fusionieren Sie den Tag an den anderen Proteinterminus oder verwenden Sie einen anderen Linker. Wenn der Strep-tag®II verwendet wird, ersetzen Sie ihn durch den Twin-Strep-tag®. Die Größe des Twin-Strep-tags kann die Zugänglichkeit verbessern.

StrepMAB-Immo wird nicht für Western Blot empfohlen, eignet sich aber hervorragend für die Erfassung von Strep-tag®-Proteinen auf festen Oberflächen (z. B. SPR, Mikrotiterplatten). Der StrepMAB-Immo-Antikörper bebötigt einen SA-Linker, um mit höchster Spezifität und Affinität zu binden. Für Western Blot verwenden Sie bitte StrepMAB-Classic HRP oder Strep-Tactin® HRP.

Für 1000 ml 1x Puffer BXT nehmen Sie 800 ml 1x Buffer W (Waschpuffer: 100 mM Tris/HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) und geben 12,2 g Biotin hinzu. Biotin löst sich nur unter alkalischen Bedingungen, aber während des Lösungsprozesses sinkt der pH-Wert des Puffers. Daher muss der pH-Wert kontinuierlich gemessen und gelegentlich mit Natriumhydroxid auf etwa pH 8 eingestellt werden. Nachdem das Biotin vollständig gelöst ist, wird die Lösung mit 1x Buffer W auf 1000 ml aufgefüllt.

Unter idealen Bedingungen kann das Resin >10 Mal ohne Leistungsverlust wiederverwendet werden.

20 ml Suspension entsprechen 10 ml Resin.

Vorgepackte 1 ml Säulen enthalten 1 ml Resin.

Beide Liganden (Strep-Tactin® und Strep-Tactin®XT) können mit beiden Tags (Strep-tag®II und Twin-Strep-tag®) kombiniert werden. Allerdings zeigt Strep-Tactin®XT in Kombination mit dem Strep-tag®II eine Bindeaffinität im nM-Bereich und mit dem Twin-Strep-tag® im pM-Bereich, während Strep-Tactin® eine Bindeaffinität im µM-Bereich für den Strep-tag®II und im nM-Bereich für den Twin-Strep-tag® aufweist. Die hohe Affinität von Strep-Tactin®XT gewährleistet im Vergleich zu Strep-Tactin® höhere Proteinausbeuten sowie eine höhere Reinheit. Darüber hinaus ist die Kombination von Strep-Tactin®XT und Twin-Strep-tag® besser für analytische Anwendungen geeignet.

Strep-Tactin® 4Flow®: pH 7 bis 8
Strep-Tactin®XT 4Flow®: pH 4 bis 10
MagStrep® Strep-Tactin®XT Beads: pH 6 bis 10

Wir empfehlen, zwei kleine, neutrale Aminosäuren, wie Serin-Alanin, zu wählen. Bitte versuchen Sie, große, aromatische, geladene oder strukturell potente Reste zu vermeiden. In unseren Vektoren sind die Linker bereits enthalten.

Strep-getag® II hat acht Aminosäuren (WSHPQFEK) und ein Molekulargewicht von 1058 Da.

Ja, es ist möglich, Strep-Tactin® 4Flow® und Strep-Tactin®XT 4Flow® Resins mit 100 mM NaOH zu regenerieren. Geben Sie 15 Säulenvolumina (CV) 100 mM NaOH zu. Unmittelbar danach 15 CV Puffer W zugeben. Bitte das Resin nicht über einen längeren Zeitraum mit NaOH inkubieren. Wir empfehlen die Verwendung von NaOH zur Reinigung der Säule von unspezifisch gebundenem oder ausgefälltem Protein.

Die Bindeaffinität liegt im mikromolaren Bereich.

Die Bindeaffinität liegt im nanomolaren Bereich.

Die Bindeaffinität liegt im nanomolaren Bereich.

Die Bindeaffinität liegt im picomolaren Bereich.

Die Bindeaffinität liegt im mikromolaren Bereich.

Die Bindeaffinität liegt im picomolaren Bereich.

Der Antikörper reagiert mit dem MW-Marker. Fügen Sie eine leere Spur zwischen dem MW-Marker und der ersten Probenspur hinzu.

Zur Blockierung von biotinylierten Proteinen auf Western Blots wird die Verwendung von 2,5 mg/ml Avidin in PBS empfohlen.

Strep-Tactin®-AP (2-1503-001), Strep-Tactin®-HRP (2-1502-001) oder StrepMAB-Classic HRP (2-1509-001) können zum Nachweis von Strep-getag®II- und Twin-Strep-tag®-Proteinen in Western Blots verwendet werden.

Nein, Milchpulver ist nicht geeignet, da es Biotin enthält, das von Strep-Tactin® HRP erkannt werden würde und daher einen hohen Hintergrund erzeugt. Bitte verwenden Sie BSA.

Nein, Milchpulver ist nicht geeignet, da es Biotin enthält, das von Strep-Tactin® AP erkannt werden würde, und daher einen hohen Hintergrund erzeugt. Bitte verwenden Sie BSA.

Ja, Sie können PVDF anstelle von Nitrocellulose verwenden. Bitte bedenken Sie, dass PVDF im Vergleich zu Nitrocellulose zu einem höheren Hintergrund führt.

1. Bitte fügen Sie immer eine Positiv- und eine Negativkontrolle bei, um zu prüfen, ob der Antikörper oder das Strep-Tactin®-Konjugat funktionsfähig ist.
2. Der primäre Antikörper und der sekundäre Antikörper sind nicht kompatibel. Verwenden Sie einen sekundären Antikörper, der gegen die Spezies ggerichtet ist, in der der primäre Antikörper erzeugt wurde (z. B. der primäre Antikörper wurde in Kaninchen erzeugt, verwenden Sie einen sekundären Antikörper gegen Kaninchen). Für Strep-getaggte Proteine kann alternativ konjugiertes Strep-Tactin verwendet werden, um inkompatible Antikörperpaare zu vermeiden.
3. Es ist nicht genug primärer oder sekundärer Antikörper an das gewünschte Protein gebunden. Verwenden Sie höhere Antikörperkonzentrationen oder inkubieren Sie länger, z. B. über Nacht bei 4 °C.
4. Kreuzreaktion zwischen Blockierungsmittel und primärem oder sekundärem Antikörper. Verwenden Sie ein mildes Detergens wie Tween 20 oder wechseln Sie das Blockierungsreagenz. Häufig verwendete Blockierungsreagenzien sind z. B. Milch, BSA, Serum oder Gelatine. Bitte beachten Sie, dass Milch nicht zum Blockieren verwendet werden kann, wenn die Detektion mit Strep-Tactin®-Konjugaten erfolgen soll, da sie Biotin enthält, das von Strep-Tactin® detektiert wird, und daher einen hohen Hintergrund erzeugt.
5. Die Antigenmenge könnte unzureichend sein. Verwenden Sie bei der Vorbereitung Proteaseinhibitoren und laden Sie mindestens 20-30 μg Protein pro Spur auf.
6. Das Protein von Interesse ist im Gewebe nicht reichlich vorhanden. Verwenden Sie einen Anreicherungsschritt, um das Signal zu maximieren, z. B. bereiten Sie Kernlysate für ein Kernprotein vor.
7. Der Transfer des Proteins auf die Membran war schlecht. Überprüfen Sie den Transfer mit einer reversiblen Färbung wie z. B. Ponceau S. Stellen Sie sicher, dass der Transfer nicht auf die falsche Weise durchgeführt wurde. Wenn Sie PVDF verwenden, denken Sie bitte daran, dass die Membran vor dem Blotting mit Methanol aktiviert werden muss.
8. Die Membran wurde zu stark gewaschen. Verringern Sie die Anzahl der Waschschritte oder die Zeit pro Schritt.
9. Wenn Sie zu lange blockieren, können Sie Ihr gewünschtes Protein nicht sichtbar machen. Wechseln Sie die Blockierungsreagenzien oder blockieren Sie kürzer. Wir empfehlen 3 % BSA und 0,05 % v/v Tween 20 in PBS für 60 Minuten.
10. Der Antikörper wurde zu oft verwendet. Verwenden Sie frische Antikörper, da die effektive Konzentration bei jeder Wiederverwendung abnimmt.
11. Der Antikörper oder das Strep-Tactin®-Konjugat wird durch Natriumazid gehemmt. Verwenden Sie Natriumazid nicht zusammen mit HRP-konjugierten Antikörpern.
12. Das Detektionskit ist zu alt und das Substrat ist inaktiv. Verwenden Sie frisches Substrat.

1. Die Blockierung unspezifischer Bindungen ist möglicherweise nicht vorhanden oder unzureichend. Erhöhen Sie die Inkubationszeit für die Blockierung und ziehen Sie einen Wechsel des Blockierungsmittels in Betracht. Wir empfehlen 3% BSA und 0,05% v/v Tween 20 in PBS für 60 min. Diese können auch in den Antikörperpuffern enthalten sein.
2. Die Konzentration des Antikörpers oder des Strep-Tactin®-Konjugats könnte zu hoch sein. Titrieren Sie den Antikörper auf die optimale Konzentration und inkubieren Sie mit der höheren Verdünnung für einen längeren Zeitraum.
3. Die Inkubationstemperatur kann zu hoch sein. Inkubieren Sie den Blot bei 4 °C.
4. Der Sekundärantikörper bindet möglicherweise unspezifisch oder reagiert mit dem Blockierungsreagenz. Führen Sie eine Sekundärantikörperkontrolle ohne Primärantikörper durch.
5. Kreuzreaktion zwischen Blockierungsmittel und primärem oder sekundärem Antikörper. Fügen Sie dem Inkubations- und Waschpuffer ein mildes Detergens wie z. B. Tween 20 zu.
6. Das Waschen von ungebundenen Antikörpern kann unzureichend sein. Erhöhen Sie die Anzahl der Waschvorgänge.
7. Die von Ihnen gewählte Membran kann einen hohen Hintergrund verursachen. Nitrocellulosemembranen verursachen weniger Hintergrund als PVDF.
8. Die Membran ist ausgetrocknet. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Membran während der Inkubation nicht austrocknet.

1. Zelllinien, die häufig passagiert wurden, akkumulieren mit der Zeit Unterschiede in ihren Expressionsprofilen. Kehren Sie zur ursprünglichen, nicht passagierten Zelllinie zurück und lassen Sie die aktuelle und die ursprüngliche Zelllinienprobe parallel laufen.
2. Die Proteinprobe weist in vivo mehrere modifizierte Formen wie Acetylierung, Methylierung, Myristylierung, Phosphorylierung, Glykosylierung usw. auf. Prüfen Sie die Literatur und verwenden Sie ein Mittel zur Dephosphorylierung, De-Glykosylierung usw. des Proteins, um es auf die richtige Größe zu bringen.
3. Das Target in Ihrer Proteinprobe wurde verdaut (was wahrscheinlicher ist, wenn die Banden ein niedrigeres Molekulargewicht haben). Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Proteaseinhibitoren in Ihren Probenpuffer einarbeiten.
4. Die Konzentration des Antikörpers oder des Strep-Tactin®-Konjugats ist zu hoch. Bei hohen Konzentrationen sind oft mehrere Banden nachweisbar. Versuchen Sie, die Antikörperkonzentration und/oder die Inkubationszeit zu verringern.
5. Das Zielprotein kann Multimere bilden. Versuchen Sie, in SDS-PAGE-Probenpuffer 10 Minuten statt 5 Minuten zu kochen, um Multimere aufzubrechen.

Während des Transfers wurden Luftblasen an der Membran eingeschlossen oder der Antikörper ist nicht gleichmäßig auf der Membran verteilt. Stellen Sie sicher, dass Sie die Luftblasen entfernen, wenn Sie das Gel für den Transfer vorbereiten. Inkubieren Sie die Antikörper unter Rühren.

Die Antikörper binden sich an das Blockierungsmittel. Filtern Sie das Blockierungsmittel.

Zu viel Antikörper oder Strep-Tactin®-Konjugat. Verwenden Sie eine höhere Verdünnung des Antikörpers oder des Strep-Tactin®-Konjugats.

Ja, sie können in DMSO aufgelöst werden.

Wir empfehlen, Peptide in Aliquots zu lagern, um mehrfache Einfrier- und Auftauzyklen zu vermeiden.