Erschließen Sie das Potenzial der Hochaffinitätsreinigung mit Strep-Tactin®XT

Strep-Tactin® und seine hochaffine Weiterentwicklung, Strep-Tactin®XT, sind Streptavidin-Mutanten, die reversibel an Strep-markierte Proteine binden. Die Unterschiede liegen in der Bindungsstärke der möglichen Tag-Ligand-Kombinationen.

Strep-Tactin®XT ist die hochaffine Option für die Reinigung von Strep-getaggten Fusionsproteinen. Mit Bindungsaffinitäten bis in den picomolaren Bereich für den Twin-Strep-tag® behält es reversible Bindungseigenschaften bei und gewährleistet eine milde Elution der immobilisierten Proteine. Diese Vielseitigkeit erstreckt sich auf verschiedene Proteinklassen und -größen und ermöglicht die effiziente Reinigung von anspruchsvollen und wenig vorhandenen Proteinen gleichermaßen. Strep-Tactin®XT fusioniert mit magnetischen Beads, MagStrep® Strep-Tactin®XT Beads, ist das ideale Werkzeug für die schnelle Batch-Reinigung in kleinen Formaten wie Reaktionsgefäßen oder 96-Well-Platten und die Identifizierung von Proteinkomplexen durch Pull-Downs.

Insbesondere Strep-Tactin®XT, fusioniert mit 4Flow®-Agarose, Strep-Tactin®XT 4Flow® high capacity Resin, bietet eine außergewöhnliche Effizienz bei der Isolierung von Strep-getaggten Proteinen aus verdünnten Zellextrakten und ermöglicht gründliches Waschen mit großen Puffermengen. Die Bindungsaffinität ist über ein breites pH-Spektrum hinweg stabil und mit verschiedenen Pufferbedingungen kompatibel, so dass Vielseitigkeit gewährleistet ist. Darüber hinaus gewährleistet die hohe Stabilität des Resins eine effektive Bindung über lange Zeiträume hinweg.

Höhere Proteinausbeute mit Strep-Tactin®XT

Mit Strep-tag®II oder Twin-Strep-tag® getaggte Proteine unterschiedlicher Größe wurden mit Strep-Tactin® und Strep-Tactin®XT gereinigt. In allen Beispielen zeigte Strep-Tactin®XT die höchste Bindekapazität (1,6-2x höher als Strep-Tactin®; linke Grafik). In einem weiteren Experiment wurde ein Fab-Fragment, das entweder mit Twin-Strep-tag® oder Strep-tag®II fusioniert war, in einer Konzentration von 0,6 mg/ml zu Zelllysaten gegeben. Die Menge des gereinigten Proteins war für das mit Strep-tag®II fusionierte Fab-Fragment mehr als dreifach niedriger, wenn Strep-Tactin® verwendet wurde (rechtes Diagramm). Dies konnte teilweise durch einen Twin-Strep-tag® ausgeglichen werden, der eine höhere Affinität zu beiden Resins aufweist. Dennoch führte die Verwendung von Strep-Tactin®XT high capacity zu der höchsten Ausbeute, unabhängig vom Affinitäts-Tag.

The maximum binding capacities of Strep-Tactin® or Strep-Tactin®XT high capacity was determined with gravity flow columns for three differently sized proteins fused to either Strep-tag®II or Twin-Strep-tag®.

A Fab fragment fused to either Strep-tag®II or Twin-Strep-tag® was added to cell lysates at a concentration of 0.6 mg/ml and subsequently purified using Strep-Tactin® or Strep-Tactin®XT high capacity FPLC columns.

Kostengünstige Proteinreinigung

Strep-Tactin®XT Resins sind aufgrund ihrer höheren Bindekapazität die kostengünstigsten Resins. Im Vergleich zu Strep-Tactin® Resins liefert das Strep-Tactin®XT Resin mehr als das Zweifache an Protein pro ml Resin und kostet bis zu 54 % weniger pro Milligramm gereinigtes Protein. Außerdem verhindert Strep-Tactin®XT das unerwünschte Herausfließen des Zielproteins während der Waschschritte.

Effizienteste Bindung: Strep-Tactin®XT:Twin-Strep-tag®

Strep-Tactin® und Strep-Tactin®XT wurden mit dem rot fluoreszierenden Protein mCherry beladen, das mit einem Twin-Strep-tag® exprimiert wurde. Strep-Tactin®XT bindet das Protein direkt im oberen Bereich (rechte Spalte), während das Strep-Tactin®-Resin fast das gesamte Resinbett bedeckt (linke Spalte). Die geringere Affinität des Tags zu Strep-Tactin® bewirkt, dass sich das Protein leichter ablöst, was zu einer geringeren Bindekapazität führt, wenn das Protein aus der Säule fließt.

Während der Waschschritte wird das Protein durch Strep-Tactin®XT fest gebunden, und während der Aufreinigung geht kein Protein verloren. Im Gegensatz dazu wird bei Strep-Tactin® Resin ein erheblicher mCherry-Verlust beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt, dass Strep-Tactin® Resins nicht mit großen Proben oder Waschvolumina kompatibel sind. In den Reinigungsschritten löst sich das Protein aufgrund der geringeren Affinität ab und läuft von der Säule, wenn das Säulenvolumen erhöht wird.

4Flow® products at a glance

A significant contrast between Strep-Tactin® and Strep-Tactin®XT resins lies in their regeneration durability. Following just a few regeneration cycles with 0,1 M NaOH, Strep-Tactin® binding decreases, resulting in lower protein yields. In contrast, the high stability of the Strep-Tactin®XT 4Flow® high capacity allow long-term use without performance loss.

Long-term use of Strep-Tactin®XT is possible due to its high stability

Hohe Affinität von Strep-Tactin®XT ermöglicht SPR-Analyse und BLI

Strep-Tactin®XT kann effizient auf SPR- und BLI-Sensoren immobilisiert werden und ermöglicht das Capturing von TST-fusionierten Liganden mit außergewöhnlich hoher Affinität im pM-Bereich. Das System ermöglicht kinetische Analysen stark bindender Analyten mit langen Dissoziationszeiten und überwindet damit die derzeitigen Einschränkungen anderer auf Affinitäts-Tags basierender Capture-Systeme, wie z. B. His-tags. Die Möglichkeit, verschiedene Liganden sogar direkt aus Kulturmedien einzufangen so wie ein einfaches Regenerationsverfahren der Biosensoren, tragen wesentlich zur Anwendung von Strep-Tactin®XT in optischen Biosensor-Assays bei.

Lesen Sie mehr über die Strep-Tactin®XT-Technologie in Downstream-Anwendungen in dieser Application Note. Erfahren Sie hier auch, warum Twin-Strep-Tag® in Kombination mit Strep-Tactin®XT eine bessere Alternative zum häufig verwendeten Avi-Tag in SPR ist .

SPR-Chips wurden mit Strep-Tactin® oder Strep-Tactin®XT beschichtet und für die Immobilisierung eines mit Twin-Strep-tag® markierten CD45-Nanobodies verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass sich der Nanobody unmittelbar nach dem Capturing von Strep-Tactin® ablöst. Im Gegensatz dazu wird der Nanobody mit Strep-Tactin®XT über einen langen Zeitraum hinweg stabil gebunden. Diese Daten zeigen, dass Strep-Tactin®XT für die Analyse von hochaffinen Wechselwirkungen mit langsamen Dissoziationsraten verwendet werden kann.

Bequeme Assays und Hochdurchsatz-Screenings mit Strep-Tactin®XT

Mit Strep-Tactin®XT beschichtete Mikrotiterplatten ermöglichen komfortable Assays und Hochdurchsatz-Screenings für Strep-getaggte Biomoleküle. Insbesondere die Kombination Twin-Strep-tag®:Strep-Tactin®XT ist mit einer _T1/2 von 13 Stunden und einer Affinität im niedrigen pM-Bereich sehr stabil. Die Tag-Ligand-Kombination ist eine effiziente und elegante Option für eine antikörperfreie Immobilisierung von Proteinen.

Darüber hinaus werden die immobilisierten Biomoleküle den Interaktionspartnern auf einheitliche Weise präsentiert , was zu zuverlässigen und hoch reproduzierbaren Assayformaten führt. Dies minimiert die unspezifische Bindung bei minimalen Variationskoeffizienten. Daher sind die Strep-Tactin®XT beschichteten Mikrotiterplatten ein präzises und gleichzeitig kosteneffizientes Werkzeug für Hochdurchsatz-Screenings und diagnostische Assays.

Effiziente Immobilisierung von (Twin-)Strep-tag®II Fusionsproteinen auf Strep-Tactin®XT
(A) Schema der orientierten Bindung rekombinanter Proteine mit N-terminalem oder C-terminalem Strep-tag® während eines fluorometrischen Mikrotiterplatten (MTP)-Tests. (B) Mit einem fluorometrischen MTP-Assay wurde die maximale Bindungskapazität von Strep-Tactin®XT untersucht und mit Strep-Tactin® verglichen. Bakterielle alkalische Phosphatase (BAP, BAP-Strep-tag®II und BAP-Twin-Strep-tag®) wurde auf Mikroplatten aufgetragen, die entweder mit Strep-Tactin® oder Strep-Tactin®XT beschichtet waren. Nach dem Waschen wurden die Mengen an gebundenem BAP bestimmt, was zeigt, dass Strep-Tactin®XT deutlich mehr Protein zurückgewinnt. (C) Vergleich der relativen maximalen Bindekapazität, die die effiziente Immobilisierung von Proteinen auf Strep-Tactin®XT zeigt.