Entwicklung und Herstellung monoklonaler Antikörper
Die Identifizierung und Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist für die Untersuchung von Immunreaktionen und die Entwicklung von Therapien essenziell. Darüber hinaus können sie für den direkten und indirekten Nachweis von Antigenen in verschiedenen Assays, als auf Mikrotiterplatten immobilisiertes Bindungsmolekül oder als Liganden für die Proteinreinigung eingesetzt werden, was sie zu einem vielseitigen Werkzeug in der Biotechnologie macht.
Für die Entdeckung monoklonaler Antikörper wurden verschiedene Methoden entwickelt, darunter die Hybridomtechnologie, das Phagen-Display oder die Sortierung einzelner B-Zellen.
Ihr gemeinsames Ziel ist die Identifizierung von Antikörpern mit hoher Affinität, die ein bestimmtes Antigen erkennen. Dies macht das Antigen zu einer zentralen Komponente bei der Antikörperentwicklung. Die Fusion eines Twin-Strep-tag® an ein Antigen ermöglicht, diese zentrale Komponente für verschiedene Schritte im Entwicklungsprozess nutzbar zu machen.
Der Twin-Strep-tag® ist geeignet für:
- Reinigung und Analyse von Antigenen (Proteinen)
- Immunisierung
- Antigen-spezifische B-Zell-Färbung und Isolierung mittels FACS
- ELISA und Western Blot
- Biosensor-Anwendungen
- Biopanning
Abbildung 1: Ein mit einem Twin-Strep-tag® fusioniertes Antigen als zentrale Komponente für alle Anwendungen, die in der Antikörperentwicklung (z. B. mittels Hybridomtechnologie, Single-B-Zell-Sortierung oder Phagen-Display) benötigt werden
Antigenexpression und -reinigung für die Antikörperentwicklung
Die Produktion eines Antigens ist ein Schlüsselprozess in der Antikörperentwicklung. Es wird für mehrere Schritte des gesamten Verfahrens benötigt, wie z. B. Immunisierung, Screening und Antikörpercharakterisierung.
Die Vorteile der Verwendung des Strep-tag®-Systems für die Antigenreinigung sind:
- Hochreine Antigenpräparate für die Immunisierung und weitere nachgeschaltete Prozesse
- Unkompliziertes Isolierungsverfahren ohne langwierige Optimierungsschritte
- Wiederverwendbarkeit auch nach CIP (Clean-in-place) Verfahren
Abbildung 2: Nach der Expression eines Antigens mit einem Twin-Strep-tag® stehen verschiedene Formate für die Proteinreinigung zur Verfügung. Die Optionen reichen von kleinem bis zu großem Maßstab mit der Möglichkeit, zwischen manuellen und automatisierten Systemen zu wechseln.
Neben den benötigten Vektoren und einem Expressionssystem stehen verschiedene Reinigungsformate zur Verfügung, die ein individuelles Up- oder Downscaling oder eine Automatisierung des Proteinproduktionsprozesses ermöglichen. Der Vorteil der Fusion eines Antigens an den Twin-Strep-stag® sind neben der hervorragenden Reinheit die vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten für verschiedene Downstream-Prozesse.
Die picomolare Affinität zu seinem Liganden erlaubt sogar den Einsatz für Biosensormessungen wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder Bio-Layer-Interferometrie (BLI). Auf diese Weise entfällt der Wechsel zwischen verschiedenen Tags je nach Anwendung, was das gesamte Verfahren schneller und effizienter macht.
Antigenanalyse für die Antikörperentwicklung
Nachdem das Antigen aus Proben wie Zelllysaten oder Zellkulturmedium gereinigt wurde, sollten die Reinheit, Integrität und Konzentration bestimmt werden. Coomassie- oder Silberfärbung sowie analytische Größenausschlusschromatographie sind Möglichkeiten, um festzustellen, ob unspezifische Proteine in einer Probe enthalten sind. Der Nachweis des produzierten Antigens über seinen Twin-Strep-tag® in einem Western Blot ist eine Möglichkeit, um festzustellen, ob das Protein erfolgreich in der erwarteten Größe produziert wurde und keine Aggregations- oder Abbauprodukte entstanden sind. Zur Bestimmung der Konzentration des gewonnenen Antigens ist ELISA eine geeignete Methode.
Abbildung 3: Verschiedene Strep-Tactin®-Konjugate ermöglichen Analysemethoden wie Western Blot oder ELISA.
Immunisierung für die Antikörperentwicklung
Die Reinigung von Proteinen mit der Strep-tag®-Technologie führt zu einem hochreinen Antigen, das sich für die Immunisierung einer Wirtsspezies eignet. Weitere optionale Verarbeitungsschritte sind die Entfernung von Biotin, dem Elutionsmittel, aus der Elutionsfraktion durch Dialyse oder Größenausschluss und/oder TEV-Spaltung des Twin-Strep-tag®. Da der Tag jedoch nur eine geringe Größe von 28 Aminosäuren hat, ist die Immunogenität voraussichtlich gering.
Abbildung 4: Der Twin-Strep-tag® ist ein kurzes Peptid, daher ist die Entfernung vor der Immunisierung nicht unbedingt erforderlich. Optional kann der Tag durch eine TEV-Protease entfernt werden.
Antigenspezifische B-Zell-Färbung und -Sortierung für die Antikörperentwicklung
Bei einigen Ansätzen zur Antikörperentwicklung werden antigenspezifische B-Zellen aus dem Blut oder anderen Geweben seropositiver Personen isoliert, die durch Infektion oder Immunisierung mit dem Antigen in Berührung gekommen sind. Hier kann man das mit dem Twin-Strep-tag® fusionierte Antigen nutzen, indem man es mit folgenden Konjugaten inkubiert:
- Fluoreszierende Strep-Tactin® oder Strep-Tactin®XT Konjugate oder
- Strep-Tactin® Magnetic Microbeads oder
- Strep-Tactin® TACS Agarose
So entstehen Selektionsreagenzien, die sich für die Färbung und/oder Sortierung von antigenspezifischen B-Zellen mittels Durchflusszytometrie, magnetischer oder affinitätschromatographischer Isolierung eignen.
B-Zellen, die das Antigen der Wahl erkennen, werden z. B. aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) selektiert. Einzelne Zellen können direkt in Lysepuffer für die Antikörpersequenzierung sortiert oder in Kultur für die Antikörperproduktion genommen werden. Diese Methode zur Herstellung monoklonaler Antikörper bietet die Möglichkeit, B-Zellen und damit auch Antikörpersequenzen direkt aus dem Menschen zu extrahieren, wodurch sich die Chance erhöht, Antikörper zu identifizieren, die für therapeutische Zwecke geeignet sind.
Abbildung 5: Das Antigen kann über seine Markierung mit Strep-Tactin®-Konjugaten kombiniert werden, z. B. für die Fluoreszenzfärbung und Sortierung von B-Zellen.
Beispielpublikationen für antigenspezifische B-Zell-Färbung und -Sortierung
Klon-/Antikörper-Screening & Antikörpercharakterisierung für die Antikörperentwicklung
Unabhängig von der für die Entdeckung monoklonaler Antikörper gewählten Methode sind Screening-Schritte der Schlüssel zur endgültigen Identifizierung des leistungsfähigsten Antikörpers.
Abbildung 6: Ein Antigen kann auf mit Strep-Tactin®XT beschichteten Mikrotiterplatten über den Twin-Strep-tag® für das Antikörperscreening mit ELISA immobilisiert werden. Aufgrund der Wiederverwendbarkeit der Platten sind mehrere Screening-Runden möglich.
ELISA
Ein Twin-Strep-tag® - Antigen kann für das Antikörperscreening mittels ELISA verwendet werden. Über seinen Tag kann es auf Strep-Tactin®XT beschichteten Mikrotiterplatten immobilisiert werden. Auf diese Weise wird die Mikrotiterplatte für die Bindung von Antikörpern z.B. aus B-Zell-Überständen funktionalisiert. Der anschließende Nachweis zeigt, welche B-Zellklone spezifische Antikörper produzieren. In der Regel sind mehrere Selektionsrunden erforderlich, um den leistungsfähigsten Klon zu finden. Da die mit Strep-Tactin®XT beschichteten Mikrotiterplatten mehrmals regeneriert werden können, ist die Verwendung der Strep-tag®-Technologie in diesem Prozess kosten- und zeitsparend.
Biopanning
Bei der Entdeckung monoklonaler Antikörper durch Phagen-Display wird eine Bibliothek von Antikörperfragmenten verwendet, die auf der Oberfläche von Bakteriophagen exprimiert werden. Um diejenigen Bakteriophagen zu finden, die Antikörperfragmente präsentieren, die das Antigen erkennen, wird ein Auswahlverfahren namens Biopanning eingesetzt. Bei dieser Methode werden die Phagen mit einem immobilisierten Antigen in Kontakt gebracht. Diejenigen, die binden, werden eluiert, vervielfältigt und in einer nächsten Selektionsrunde verwendet. Für die Selektionsrunden bieten Strep-Tactin®XT beschichtete Mikrotiterplatten mit einem immobilisierten Twin-Strep-tag®-Antigen ein wiederverwendbares, kostensparendes System, das dem Antikörperscreening mittels ELISA ähnelt. Nach der Identifizierung von Antikörperfragmenten, die das Antigen spezifisch binden, müssen die Sequenzen für die weitere Verwendung in der Forschung oder für therapeutische Anwendungen als vollständige Antikörper kloniert werden. Da dieser Schritt die Eigenschaften eines Antikörpers potenziell verändern kann, sind zusätzliche Charakterisierungsschritte erforderlich, so dass diese Methode zur Entdeckung monoklonaler Antikörper insgesamt sehr arbeitsintensiv ist.
Abbildung 7: Mit Strep-Tactin®XT beschichtete Mikrotiterplatten eignen sich für das Biopanning, ein Selektionsverfahren, das im Phagen-Display eingesetzt wird. Die Platten können mehrfach regeneriert werden, so dass mehrere Selektionsrunden möglich sind.
Abbildung 8: Aufgrund der picomolaren Affinität von Strep-Tactin®XT zum Twin-Strep-tag® sind Biosensoranwendungen wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) möglich.
SPR & BLI
Die Antikörper, die durch verschiedene Ansätze zur Entdeckung und Entwicklung von Antikörpern gewonnen werden, können durch Biosensoranwendungen wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) oder Bio-Layer-Interferometrie (BLI) weiter charakterisiert werden. Auch hier ist das Twin-Strep-getaggte Antigen von zentraler Bedeutung für diese Analysen. Aufgrund der picomolaren Affinität des Twin-Strep-tag® zu Strep-Tactin®XT ist das Antigen ausreichend immobilisiert, um die Bindungskinetik an einen ausgewählten Antikörper zu bestimmen. Auf diese Weise werden Antikörper mit den gewünschten Affinitäten identifiziert und für die Produktion im großen Maßstab ausgewählt.
