Scale-up der Proteinaufreinigung
Die Skalierbarkeit der Proteinreinigung ist für die an der Prozessentwicklung beteiligten Forscher von entscheidender Bedeutung. Während in der Screening-Phase nur wenige Mikrogramm Protein benötigt werden, können in späteren Phasen mehrere Milligramm oder sogar Gramm erforderlich sein. Doch welche Art von Resin (z. B. Agarose-Resin oder magnetische Beads) oder welches Format (z. B. Spin-Säulen, FPLC-Säulen usw.) ist für jeden Maßstab geeignet? In den folgenden Abschnitten werden die empfohlenen Typen und Formate für die verschiedenen Maßstäbe der Proteinreinigung erläutert.
Proteinreinigungssäulen, wie Spin-Säulen, Gravity-Flow-Säulen und FPLC-Säulen von IBA Lifesciences, sind mit Agarose-Resin vorgepackt und haben ein definiertes Harzbettvolumen von bis zu 10 ml. Daher bieten sie nur eine begrenzte Ausbeute und werden in erster Linie für Screening und Anwendungen im Labormaßstab empfohlen.
Sowohl magnetische Beads als auch Agarose-Resin können für die Proteinaufreinigung verwendet werden, von der Screening-Phase bis zur Proteinproduktion im Labormaßstab. Für die Proteinproduktion im großen Maßstab wird Agarose-Resin empfohlen. Beide Optionen sind als Suspensionen in verschiedenen Füllgrößen erhältlich, so dass das Resin-bettvolumen individuell gewählt und leicht an die spezifischen Reinigungsbedingungen angepasst werden kann. In den folgenden Abschnitten wird die optimale Verwendung dieser Formate für die Proteinreinigung beschrieben, vom Screening bis zur Produktion im großen Maßstab.
Empfohlener Anwendungsbereich der Proteinreinigungsprodukte von IBA Lifesciences in Abhängigkeit von der Proteinreinigungsskala.
Hochskalierung von Agarose-Resin
Agarose-Resins eignen sich für Anwendungen, die vom Screening bis zur Proteinreinigung im großen Maßstab reichen. Im Gegensatz zu magnetischen Beads werden sie jedoch nicht für Batch-Verfahren empfohlen, da Agarose-Resin beim Pipettieren leicht verloren geht und der Überstand nicht vollständig entfernt werden kann.
Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn Agarose-Resin in Spitzen oder Säulen gepackt wird, die für Zentrifugations-, Schwerkraftfluss- oder Flüssigkeitschromatographiesysteme ausgelegt sind.
Für Screening-Anwendungen sind mit Agarose-Resin gefüllte Spinsäulen ideal, wenn nur wenige Proben parallel gereinigt werden müssen. Für die Proteinaufreinigung mit hohem Durchsatz und vielen kleinen Proben sind die mit IMCS-Resin gefüllten Spitzen jedoch eine einfache und effiziente Lösung, insbesondere in Verbindung mit Robotersystemen.
Erfahren Sie in dieser Application Note, wie Strep-Tactin®XT 4Flow® high capacity Resin in Kombination mit IMCStips® hervorragende Ergebnisse erzielt.
Proteinaufreinigung im kleinen Maßstab und mit hohem Durchsatz mit Strep-Tactin®XT 4Flow® high capacity Resin, gefüllt in IMCStips®. A) Schematische Darstellung der automatisierten Proteinaufreinigung mit IMCStips®. B) SDS-PAGE-Gel, das die Aufreinigung von TST-CD34 mAB aus CHO-S-Überstand mit IMCStips® auf einem Hamilton Microlab® STAR™ zeigt. Der Aufreinigungsprozess führte zu einer Reinheit von >95 %.
Für den Labormaßstab bietet IBA Lifesciences sowohl vorgepackte Gravity-Flow-Säulen (0,2 ml bis 10 ml Harzbettvolumen) als auch FPLC-Säulen (1 ml und 5 ml Harzbettvolumen) an, die alle mit 4Flow ®-Agarose-Resins erhältlich sind. Gravity-Flow- säulen sind ideal für kleine Probenvolumina und für die Aufreinigung einer begrenzten Anzahl von Proben parallel. Außerdem ist keine spezielle Laborausrüstung erforderlich. Für größere Probenvolumina empfehlen sich FPLC-Säulen, die mit Chromatographiesystemen, wie z.B. einer Äkta ®, verwendet werden. FPLC-Säulen können auch in Reihe geschaltet werden, um das Resin-bettvolumen und die Proteinbindungskapazität zu erhöhen. Wenn FPLC-Säulen nicht in Frage kommen, können große Probenmengen auch mit Hilfe der Applikationshilfe WET FRED auf Gravity-Flow- Säulen aufgetragen werden.
FPLC-Säulen eignen sich auch für die Aufreinigung von Proteinen im großen Maßstab. Zu diesem Zweck bietet IBA Lifesciences Agarose-Resin in 1-L-Flaschen an, mit denen die Anwender große FPLC-Säulen selbst befüllen können. Das beste Preis-Leistungs-Verhältnis wird mit dem Strep-Tactin®XT 4Flow® high capacity Resin erzielt, das eine sehr hohe Proteinbindungskapazität von 31 mg Protein pro ml Agarose-Resin aufweist (bestimmt mit einem 52 kDa Twin-Strep-tag Fusionsprotein). Andere Agarose-Resins, Strep-Tactin® 4Flow® high capacity und Strep-Tactin®XT 4Flow®, bieten geringere Proteinbindungskapazitäten, aber die gleiche Spezifität für den Strep-tag® und liefern eine ebenso hohe Proteinreinheit.
Die Anwendungen von Agarose-Resins und magnetischen Beads sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Für einen detaillierten Vergleich ihrer Spezifikationen finden Sie hier eine Übersicht.
Hochskalierung von magnetischen Beads
In der frühen Screening-Phase können die magnetischen Beads in Kombination mit Pipettierrobotern oder in kleinen Reaktionsgefäßen verwendet werden. Sie sind hoch skalierbar und für den direkten Einsatz in Batch-Prozessen geeignet. Ein Beispiel für die automatisierte Hochdurchsatz-Reinigung mit dem Tecan Fluent® System findet sich im Poster „From screening to large scale purification: adaptability of MagStrep® Strep-Tactin® XT beads“ .
Wenn der Bedarf an gereinigtem Protein im Labormassstab steigt, kann die Menge an MagStrep® Strep-Tactin® XT Beads einfach erhöht werden, wobei die gleiche Ausbeute pro Milliliter und die Proteinreinheit beibehalten werden. Magnetische Beads werden jedoch nur selten für die Proteinaufreinigung im Labormaßstab verwendet, da ihre Kosten pro Milliliter im Allgemeinen höher sind als die von Agarose-basierten Harzen. Trotzdem können die MagStrep® Strep-Tactin® XT-Beads häufig regeneriert werden, ohne dass sie ihre Proteinbindungskapazität verlieren. Diese Wiederverwendbarkeit in Verbindung mit ihrer hohen Bindungskapazität und Reinheit kann die Prozesskosten erheblich senken. Darüber hinaus sind keine speziellen Laborgeräte oder Fachkenntnisse erforderlich - nur ein geeigneter Magnet, wie er von Sepmag® bereitgestellt wird.
Erfahren Sie mehr über die Skalierbarkeit von MagStrep® Strep-Tactin® XT Beads für die Proteinaufreinigung in der Application Note
Die einfache Skalierbarkeit des Aufreinigungsprozesses mit MagStrep® Strep-Tactin®XT-Beads wurde durch Aufreinigung eines Twin-Strep-tag®-Fusionsproteins aus verschiedenen Probengrößen getestet (A). Die Skalierung der Aufreinigung führt zu einer zunehmenden Menge an isoliertem Protein (B) bei gleichbleibender Ausbeute pro ml Lysat (C).
