Wie lassen sich häufige Probleme im Zusammenhang mit dem His-tag-System umgehen?
Der His-tag (6xHis-tag, His6-tag oder Polyhistin-tag) ist ein beliebter Affinitäts-Tag für die Proteinreinigung, da seine geringe Größe eine geringe Auswirkung auf die Proteinstruktur gewährleistet. Während das His-tag-System wegen seiner hohen Ausbeute und niedrigen Kosten beliebt ist, wird der Zeit- und Arbeitsaufwand für eine erfolgreiche His-tag-Reinigung oft nicht berücksichtigt.
- Geringe Proteinreinheit aufgrund unspezifischer Bindung von Wirtsproteinen (Abbildung 1A)
- Proben- oder Pufferkomponenten stören die Proteinbindung
- Proteinausfällung nach der Reinigung aufgrund von inkompatiblen Pufferkomponenten
- Kulturmedien für Säugetierzellen stören die Proteinbindung oder verursachen Ni2+-Leakage
- Der für das Zielprotein erforderliche pH-Wert führt zur Elution aus der Ni-NTA-Agarose
- Eingeschränkte Anwendbarkeit in der Proteinanalyse aufgrund geringer Tag-Liganden-Affinität und -Spezifität
Um diese Probleme zu vermeiden oder zu lösen, ist eine sorgfältige Planung des Verfahrens und eine Optimierung des His-tag-Reinigungsprotokolls erforderlich. Schließlich kann es vorkommen, dass ein His-tag immer noch keine zufriedenstellenden Ergebnisse liefert oder für eine bestimmte Art von Protein überhaupt nicht geeignet ist. In diesem Fall sollte ein anderer Affinitäts-Tag in Betracht gezogen werden.
Das Strep-tag®-System ist die ideale Alternative zum His-tag, da alle üblichen Probleme vermieden werden. Aufgrund der spezifischen Tag-Ligand-Interaktion führt die Proteinisolierung mit diesem System zu hochreinem Protein ohne weitere Optimierungs- oder Verarbeitungsschritte (Abbildung 1B).
Abbildung 1: GFP, das entweder an einen 6xHis-tag (A) oder an einen Twin-Strep-tag® (B) fusioniert ist, wurde aus E. coli-Lysaten isoliert, wobei die Standardprotokolle der Hersteller der verwendeten Resins (Ni-NTA von Thermo Fisher Scientific für His-tag und Strep-Tactin®XT 4Flow® high capacity von IBA Lifesciences für Twin-Strep-tag®) verwendet wurden.
Sehen Sie sich unser kostenloses On-Demand-Webinar über häufige Probleme bei der His-tag-Reinigung an und lesen Sie unser Whitepaper, das His-tag- und Strep-tag®-Proteinreinigungssysteme vergleicht.
Was sind die Ursachen für Verunreinigungen bei der His-tag-Reinigung und wie lassen sich Verunreinigungen beseitigen?
His-tag wird durch Übergangsmetallionen gebunden, von denen Nickel (Ni2+) am häufigsten verwendet wird. Nitrilotriessigsäure (NTA) oder Iminodiessigsäure (IDA) dienen normalerweise als Trägermatrix für Ni2+. Beim His-tag-Reinigungssystem, einer Art immobilisierter Metallaffinitätschromatographie (IMAC), können sowohl die Art des Tags als auch die entsprechenden Tag-bindenden Metallionen (z. B. Ni2+, Kobalt (Co2+) oder Kupfer (Cu2+)) Verunreinigungen verursachen:
Abbildung 2: Da His-haltige Proteine unspezifisch an Ni-NTA-Resins binden, ist eine Titration von Wasch- und Elutionspuffern erforderlich. Darüber hinaus können weitere Verarbeitungsschritte wie z. B. Größenausschlusschromatographie oder Filtration erforderlich sein, um die Reinheit für weitere Experimente ausreichend zu erhöhen. Bei diesem Schritt geht Protein verloren, was die Gesamtproteinausbeute verringert. Im Gegensatz dazu binden Strep-tag®II und Twin-Strep-tag® mit hoher Spezifität an ihre Liganden, was zu einem hochreinen Proteinpräparat führt, welches direkt für weitere nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden kann.
- "His" oder "Histidin" ist eine Aminosäure, die in Wirtsproteinen vorkommen kann. Aufeinanderfolgende His-Reste verursachen eine unspezifische Bindung an die chelatierten Metalle auf dem His-tag-Reinigungsresin.
- Wirtsproteine können eine intrinsische Affinität zu Ni2+ oder Co2+ haben.
Um die Reinheit von His-tag-Proteinen zu erhöhen, bieten mehrere Schritte vor, während und nach dem Reinigungsprozess Optimierungspotenzial.
In einem ersten Schritt kann dem Zelllysepuffer und den Waschpuffern das Elutionsmittel Imidazol in niedriger Konzentration zugesetzt werden. Auf diese Weise kann eine unspezifische Bindung von intrinsischen Proteinen mit His-tag verhindert werden. Die Imidazolkonzentration, die nur die Bindung von His-haltigen Wirtsproteinen hemmt und die Bindung von 6xHis-markierten Zielproteinen noch zulässt, muss jedoch sorgfältig titriert werden. Ebenso kann eine schrittweise Anpassung der Imidazolkonzentration während der Elution dazu beitragen, His-tag-Verunreinigungen zu eliminieren. Wenn diese Ansätze nicht erfolgreich sind, kann eine Erhöhung der Anzahl der His-Reste von z. B. 6 auf 10 eine stärkere Bindung des Zielproteins bewirken und höhere Imidazolkonzentrationen beim Waschen ermöglichen, um Verunreinigungen zu entfernen. Dies bedeutet jedoch, dass man wieder bei Null anfangen muss, da die Proteinexpression angepasst werden muss.
Ist die Reinheit des His-tag-Zielproteins nach Änderung des Reinigungsverfahrens nicht zufriedenstellend, können zusätzliche Verarbeitungsschritte in Betracht gezogen werden. Dazu gehören Größenausschluss- oder Ionenaustauschchromatographie, Filtration oder Dialyse. Der Nachteil dabei ist, dass alle zusätzlichen Schritte Proteinverluste und zusätzliche Kosten verursachen können (Abbildung 2).
Im Gegensatz dazu wurden die beiden Tags, die bei der Strep-tag®-basierten Proteinreinigung verwendet werden (Strep-tag®II und Twin-Strep-tag®), speziell für den Einsatz in dieser Technologie entwickelt. Im Gegensatz zu His-Resten ist es daher unwahrscheinlich, dass sie auf natürliche Weise in Proteinen vorkommen und an das Reinigungsresin binden (Abbildung 3). Falls bei der Strep-tag®-Reinigung Verunreinigungen auftreten, handelt es sich in der Regel um biotinylierte Proteine, die leicht und spezifisch mit Avidin blockiert werden. Ansonsten können gebrauchsfertige Wasch- und Elutionsverfahren wie empfohlen angewendet werden.
Abbildung 3: E. coli-Lysat wurde zu Ni-NTA (A) oder zu Strep-Tactin®XT 4Flow® high capacity (HC) Resin (B) gegeben. Verunreinigungen wurden nur bei Ni-NTA-Resin aufgrund unspezifischer Bindung von Proteinen mit His-Resten beobachtet.
