ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay, kurz ELISA, ist eine häufig angewandte Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Liganden wie Proteinen, Peptiden oder Hormonen auch in einem komplexen Gemisch. ELISA ist eine plattenbasierte Technik, bei der je nach Typ entweder der Zielligand oder das Bindereagenz auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert wird. Es gibt zwar verschiedene Arten von ELISA, aber die wesentlichen Bestandteile sind immer gleich. Erstens, ein Ligand von Interesse, der nachgewiesen und möglicherweise quantifiziert werden soll. Zweitens einen Antikörper, wie StrepMAB-Immo oder StrepMAB-Classic, oder ein anderes Nachweisreagenz, wie unser konjugiertes Strep-Tactin®XT zur spezifischen Erkennung des Liganden. Und schließlich ein enzymatischer Reporter, dessen Substratumwandlung als messbares Signal verwendet werden kann.

Es gibt zwar verschiedene Formate, aber das Grundprinzip ist bei jeder Art von ELISA das gleiche.

1. Beschichtung oder Einfangen des direkt oder indirekt immobilisierten Liganden auf der Mikrotiterplatte.
2. Blockieren der freien Oberflächenbindungsstellen der Mikrotitetplatte.
3. Nachweis des Liganden durch Verwendung ligandspezifischer Reagenzien, z. B. Antikörper.
4. Auslesen des Signals, das durch die enzymatische Reaktion des markierten primären oder sekundären Antikörpers entsteht.
   

Je nach den experimentellen Anforderungen kann man zwischen direktem, indirektem und Sandwich-ELISA wählen. Die Formate unterscheiden sich in der Art und Weise, wie der Ziel-Ligand eingefangen und nachgewiesen wird.

Sowohl der direkte als auch der indirekte ELISA beginnen mit der Immobilisierung des Liganden auf einer Mikrotiterplatte. Während beim direkten ELISA nur ein markierter primärer Antikörper zum Nachweis benötigt wird, wird beim indirekten ELISA zunächst ein unmarkierter primärer Antikörper und dann ein markierter sekundärer Antikörper verwendet. Anstelle eines primären Antikörpers können jedoch auch Strep-Tactin®- oder Strep-Tactin®XT-Konjugate für Strep-getaggte Liganden verwendet werden, was besonders vorteilhaft ist, da ein zweiter Antikörper für die empfindliche Signalerkennung überflüssig wird. Alternativ kann StrepMAB-Classic, das mit HRP konjugiert ist, verwendet werden, was ebenfalls die Verwendung eines sekundären Antikörpers überflüssig macht.
Bei einem Sandwich-ELISA wird die Platte mit einem bindenden Molekül, wie einem Antikörper, beschichtet. Anschließend wird der Ligand zugegeben und zwischen dem einfangenden und dem nachweisenden Antikörper "eingeklemmt". Dabei ist der primäre Antikörper, der den Liganden nachweist, in der Regel unmarkiert, während ein markierter sekundärer Antikörper zur Quantifizierung hinzugefügt wird. Um ein gewünschtes Strep-getaggtes Protein zu erfassen, können die Platten mit unserem StrepMAB-Immo oder StrepMAB-Classic-Antikörper beschichtet werden. Wir empfehlen jedoch StrepMAB-Immo für diesen Zweck aufgrund seiner höheren Affinität gegenüber dem Strep-tag®. Zusätzlich sind praktische vorbeschichtete Platten mit Strep-Tactin® oder Strep-Tactin®XT erhältlich.
Als enzymatischer Reporter wird meist die Horseradish Peroxidase (HRP) eingesetzt. Sie wandelt ein bestimmtes Substrat in ein nachweisbares Produkt um. Als Substrat stehen eine Vielzahl verschiedener chromogener, fluoreszierender und chemilumineszierender Produkte zur Verfügung, immer in Abhängigkeit von der gewünschten Empfindlichkeit und der vorhandenen Laborausstattung. Falls eine fluoreszierende Nachweismethode gewünscht wird, bieten wir verschiedene fluoreszierende Marker an, die an Strep-Tactin®XT, StrepMAB-Immo oder StrepMAB-Classic konjugiert sind.