Anwendungsbeispiele
Nachweis mit Strep-tag® Antikörpern
StrepMAB-Classic und StrepMAB-Immo können zur Detektion von Strep-tag®II- oder Twin-Strep-tag®-Proteinen auf Zelloberflächen, in der Zelle, in Zelllysaten oder in Eluaten nach der Proteinreinigung eingesetzt werden. Als Beispiel wird die Anwendung für Durchflusszytometrie gezeigt.
StrepMAB-Classic DY-549
Anwendung: Durchflusszytometrie
Verdünnung: 1:500
HeLa-Zellen wurden transient mit der kodierenden Sequenz von SARS-CoV-2 ORF3a-Twin-Strep-tag transfiziert. Nach 48 Stunden Transfektion wurden die Zellen abgetrennt, vorsichtig trypsinisiert und mit StrepMAB-Classic DY-549 (1:500, 0,5% BSA + 1 mM EDTA, 30 min auf Eis) gefärbt. Die intrazellulären SARS-CoV-2 ORF3a-Twin-Strep-tag-Konzentrationen wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen (4 Laser Cytoflex S, Beckman Coulter) Quelle: Daten, die freundlicherweise von James Edgar, Abteilung für Pathologie der Universität Cambridge, zur Verfügung gestellt wurden.
Fluoreszierende Zellfärbung für die Durchflusszytometrie mit Strep-Tactin® und Strep-Tactin®XT Konjugaten
Die Strep-tag®-Technologie bietet verschiedene Optionen für die Zellfärbung.
Direkte vs. indirekte Färbung
Direkte Färbung von Zellen, die ein Protein mit einem Strep-tag®II oder einem Twin-Strep-tag® auf der Oberfläche exprimieren
Indirekte Färbung über ein zellbindendes Protein (z. B. ein Fab-Fragment, ein MHC-Molekül oder ein Antigen), das mit einem Strep-tag®II oder einem Twin-Strep-tag® fusioniert ist
Direkte Färbung
Der Strep-tag®II oder Twin-Strep-tag® sind kurze Peptidsequenzen, die auf einer Zelloberfläche exprimiert werden können, ohne die Eigenschaften der Zelle zu beeinträchtigen. Die Kopplung eines der Tags an ein Oberflächenprotein der Wahl ermöglicht eine einfache Auswahl von Zellen, die dieses Protein erfolgreich exprimieren. MEXi-Zellen, die ein mit einem Twin-Strep-tag® fusioniertes Oberflächenprotein exprimieren, wurden mit nativen MEXi-Zellen in einem Verhältnis von etwa 1:1 gemischt. 1 x 106 Gesamtzellen wurden mit Strep-Tactin®XT DY-649 in einer Verdünnung von 1:5000* (A) oder mit Strep-Tactin®XT APC in einer Verdünnung von 1:1000* (B) gefärbt. Die Färbung erfolgte in 100 µl Buffer CI (1x PBS mit 1 mM EDTA und 0,5% BSA) für 30 Minuten bei 4°C.
*Die optimale Verdünnung kann für einzelne Versuchsaufbauten erforderlich sein. Darüber hinaus hängt die Wahl des Konjugats von Faktoren wie der Proteindichte auf der Zelloberfläche ab. Aufgrund ihrer helleren Färbung können PE- und APC-Konjugate bei gering exprimierten Zielen von Vorteil sein.
Indirekte Färbung über Strep-getaggtes Protein (Fab)
Für die Färbung zytotoxischer T-Zellen wurden 200 ng anti-humanes CD8-Fab-Fragment (50 kDa), das mit einem Twin-Strep-tag® fusioniert ist, mit 75 ng Strep-Tactin®XT APC (A) oder Strep-Tactin®XT DY-649 (B) für 10 Minuten bei 4 °C vorinkubiert. Die gebildeten Komplexe wurden zu 5 x 106 peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) gegeben und für 20 min bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden zusätzliche Färbeantikörper zugegeben. Beide fluoreszierenden Konjugate ermöglichten eine klare Trennung von positiven und negativen Zellpopulationen, was eine flexible Auswahl von Fluorophoren für hoch exprimierte Zielproteine wie CD8 auf der Oberfläche von T-Zellen zeigt.
Indirekte Anfärbung von T-Zellen über ein Strep-getaggtes Protein (MHC)
Für die Anfärbung von Targets mit niedriger Affinität, wie z. B. T-Zell-Rezeptoren, ist eine Multimerisierung des Liganden erforderlich, um eine stabile Bindung des Nachweisreagenzes an die Zelle zu ermöglichen. Diese Multimerisierung kann mit Strep-Tactin® oder Strep-Tactin®XT PE- oder APC-Konjugaten erreicht werden.
Für die antigenspezifische T-Zell-Färbung wurden 200 ng eines MHC-Klasse-I-Moleküls, das mit einem Twin-Strep-tag® (50 kDa) fusioniert und mit einem vom Cytomegalovirus (CMV) stammenden Peptid rückgefaltet war, mit 75 ng Strep-Tactin® PE (A) oder Strep-Tactin®XT PE (B) 15 Minuten lang bei 4 °C vorinkubiert. 1 x 107 PBMCs in 100 µl Puffer wurden zu den Färbekomplexen gegeben und 20 min bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden weitere Färbeantikörper zugegeben.
Strep-Tactin®XT PE erreichte eine hellere Färbeintensität als Strep-Tactin® PE, was darauf hindeutet, dass Strep-Tactin®XT PE und APC die bevorzugten Konjugate für niedrig affine und niedrig exprimierte Zielmoleküle wie spezifische T-Zell-Rezeptoren sind. Die Konjugate Strep-Tactin®XT DY-649, DY-549 und DY-488 werden für diesen Ansatz nicht empfohlen, da ihre geringere Helligkeit keine ausreichende Färbung bewirkt (Daten nicht gezeigt).
