Klonieren

Ziel der molekularen Klonierungsverfahren ist es, ein gewünschtes Gen in einen geeigneten Expressionswirt einer kompatiblen Weise (rekombinante DNA) einzubringen, um schließlich das Genprodukt (Protein) in zufriedenstellender Qualität und Quantität herzustellen. Klonen bedeutet die Herstellung identischer Kopien eines bestimmten Gens von Interesse. Bei der Klonierung wird das Gen vervielfältigt und dann in ein Plasmid (Vektor) eingefügt, um es anschließend zu replizieren und das Protein zu exprimieren. Die Verwendung von Plasmiden ermöglicht den Schutz des fremden genetischen Materials vor den angeborenen Abbaumechanismen des Expressionswirts.

Different restriction enzyme types and its cleavage sites

Es gibt verschiedene Klonierungsverfahren, um das gewünschte Gen in ein Plasmid einzufügen. Das Klonieren auf der Basis von Restriktionsenzymen ist die Standardklonierungsmethode in der Molekularbiologie. Restriktionsendonukleasen spalten doppelsträngige DNA (dsDNA) an spezifischen Sequenzstellen, den sogenannten Erkennungsstellen. Je nach verwendetem Restriktionsenzym können die erzeugten DNA-Fragmente entweder stumpfe Enden oder klebrige Enden haben. Diese können mit Plasmid-DNA fusioniert werden, wenn diese mit demselben Restriktionsenzym gespalten und dadurch linearisiert vorliegt. Die Fusionierung des DNA-Fragments und der linearisierten Plasmid-DNA erfolgt mit Hilfe einer sogenannten DNA-Ligase.

Eine spezielle Klonierungsmethode nutzt die spezifischen Eigenschaften von Typ-IIS-Restriktionsenzymen, Endonukleasen, die DNA außerhalb der Erkennungssequenz schneiden. Im Gegensatz zur traditionellen Klonierung mit Restriktionsenzymen bietet dieses Schneiden außerhalb der Erkennungsstelle den Vorteil, dass individuelle Überhänge erzeugt werden können. Mit dem StarGate-System hat IBA diesen Ansatz genutzt, um kompatible individuelle Überhänge zu erzeugen, die dann effizient fusioniert werden können. Das StarGate-System wird mit einer großen Anzahl an Klonierungs- und Expressionsvektoren für verschiedene Expressionswirte zu Verfügung gestellt.

StarGate für schnelles Klonieren

StarGate wurde für das schnelle systematische Screening des optimalen Expressions- (in Bezug auf den Expressionswirt und/oder den Promotor) und Reinigungssystems (in Bezug auf den Affinitäts-Tag) für ein bestimmtes Gen von Interesse (GOI) entwickelt.

Direktes Transfer-Klonieren

gene of interest can be directly inserted into the appropriate expression vector

Das direkte Transferklonierungsverfahren wird empfohlen, wenn das optimale Expressions- und Reinigungssystem bereits bekannt ist. Bei diesem Verfahren kann ein PCR-Produkt, das das betreffende Gen enthält, direkt in den entsprechenden Expressionsvektor (Akzeptorvektor) eingefügt werden.

Im ersten Schritt wird das Gen von Interesse (GOI) an beiden Enden mit kombinatorischen Stellen (orange und rot) und den Esp3I-Erkennungsstellen (hellblau) über Polymerasekettenreaktion (PCR) ausgestattet, um eine Insertion in der korrekten Orientierung zu ermöglichen. Das PCR-Produkt wird im zweiten Schritt in den entsprechenden Expressionsvektor integriert, wodurch das endgültige Expressionskonstrukt, der so genannte Zielvektor, entsteht. Die Bildung des korrekten Zielvektors wird durch blau-weißes Screening auf LB-Agar-Platten mit X-Gal überprüft.

"Zwei-Schritt-Klonierung" über pENTRY-IBA

Die StarGate-Klonierung über den pENTRY-IBA-Vektor bietet ein Werkzeug für die systematische und schnelle Suche nach den besten Expressionsbedingungen für eine bestimmte GOI, für die in der Literatur nichts bekannt ist. Nach der anfänglichen pENTRY-Klonierung kann die GOI im resultierenden Donor-Vektor durch eine einfache Ein-Tube-Reaktion leicht in eine Vielzahl von Akzeptor-Vektoren mit unterschiedlichen Eigenschaften übertragen werden.

the gene of interest (GOI) will be equipped at both termini with combinatorial sites and the LguI recognition sites

Schritt 1: Eingangsklonierung für die Erzeugung von Spendervektoren

Im ersten Schritt wird das Gen von Interesse (GOI) an beiden Enden mit kombinatorischen Stellen und den LguI-Erkennungsstellen ausgestattet, die für die orientierte Insertion des PCR-Fragments in pENTRY-IBA51 wichtig sind. Dies geschieht durch PCR unter Verwendung einer proofreading-Polymerase.

Die Rekombination des PCR-Produkts mit dem Eingangsvektor an den kombinatorischen Stellen (rot und orange) führt zur Erzeugung des Spendervektors. Bei diesem Schritt gehen die LguI-Restriktionsstellen (dunkelorange mit Pfeilspitzen) verloren, wodurch die Rekombinationsreaktion unidirektional und damit hocheffizient ist.

Im resultierenden Donor-Vektor werden dieselben kombinatorischen Stellen nun von den Esp3I-Erkennungsstellen (hellblau) flankiert, wodurch ein hocheffizienter und spezifischer StarGate®-Gentransferprozess in Akzeptor-Vektoren in ähnlicher Weise ermöglicht wird.

the GOI is transferred from the Donor Vector into an Expression vector

Schritt 2: Transfer-Klonierung (Erzeugung des Zielvektors)

In der Transferreaktion wird die GOI aus dem Donor-Vektor in einen Expressionsvektor (Akzeptor-Vektor) übertragen. Die Akzeptor-Vektoren bieten die gewünschte genetische Umgebung (d. h. Affinitäts-Tag, Promotor (Prom), zusätzliche Signalsequenzen usw.). In Fällen, in denen die optimalen Expressions- und Reinigungsbedingungen für die GOI nicht bekannt sind, sollten verschiedene Akzeptor-Vektoren ausgewählt werden.

Der Transfer vom Donor-Vektor in den Akzeptor-Vektor wird durch Esp3I als Restriktionsenzym und T4-DNA-Ligase vermittelt. Im resultierenden Zielvektor wird die GOI unter die Kontrolle des ausgewählten Promotors (Prom) gestellt, was die GOI-Expression im ausgewählten Expressionswirt ermöglicht. In diesem Beispiel ist ein Affinitäts-Tag (grün) an das C-terminale Ende des GOI-Expressionsprodukts fusioniert.

Besondere Merkmale der StarGate-Klonierung

Klonierung über Gensynthese

Gensynthese - der einfache Weg zur Erstellung Ihres StarGate-Donor-Vektors

In den letzten zehn Jahren sind die Preise für Gensyntheseleistungen immer günstiger geworden. Daher ist die Gensynthese, die von einer Vielzahl von wissenschaftlichen Dienstleistern angeboten wird, eine schnelle und einfache Alternative zur Erstellung eines StarGate Donor Vektors, der Ihr GOI (Gen von Interesse) enthält. Im Vergleich zu Standardklonierungsverfahren (über PCR, Restriktionsenzymverdau, Reinigung, Ligation) ist die Gensynthese eine bequeme Möglichkeit, einen StarGate-Donor-Vektor zu erzeugen und zugleich die Codonverwendung Ihres GOI zu optimieren, um eine verbesserte Proteinexpression in Ihrem speziellen Wirt zu erreichen.

Enter the sequence of your gene of interest

So erzeugen Sie einen StarGate-Donor-Vektor mit Hilfe eines Gensynthesedienstes:

Geben Sie die Sequenz Ihrer GOI ohne Start- und Stoppcodon ein
Wählen Sie eine spezifische Codon-Optimierung für Ihren endgültigen Wirt. Fügen Sie die Esp3I-Erkennungsstelle und die entsprechenden kombinatorischen Stellen hinzu:
Start: 5'-AGCGCGTCTCCAATG
Stopp: 3'-GGGAGGAGACGCGCT
Wählen Sie einen Standardklonierungsvektor (vom Dienstleister angeboten), der ein Antibiotikaresistenzgen für Kanamycin enthält.

Expressionsvektoren (Akzeptor-Vektor)

IBA-Akzeptorvektoren bieten verschiedene genetische Umgebungen für eine optimale Proteinexpression und -reinigung. Dazu gehören verschiedene Reinigungs-Tags, Promotoren für eine Vielzahl von Wirtszellen, Signalsequenzen usw.

E.coli

pASG-IBA-Vektoren

Hochgradige Expression in E. coli, auch für toxische Proteine
Streng regulierte Expression durch den Anhydrotetracyclin-induzierbaren Teterazyklin-Promotor/Operator
Möglichkeit der periplasmatischen Expression durch die ompA-Signalsequenz
Keine Katabolitenunterdrückung - kein Einfluss von Mediumkomponenten
Keine Beeinflussung durch den genetischen Hintergrund - in einer große Auswahl an E. coli-Expressionsstämmen einsetzbar
Kostengünstige Induktion mit AHT

Hefe

pYSG-IBA-Vektoren

Hochgradige Expression in Hefe
Streng regulierte Expression durch den Cu²⁺-induzierbaren CUP1-Promotor
Ampicillin-Resistenzkassette zur Selektion von transformierten E. coli-Zellen
ColEl origin für eine hohe Plasmid-Kopiezahl in E. coli
Leu2d Auxotrophie-Marker zur Erhöhung der Plasmid-Kopienzahl
URA Auxotrophie-Marker zur Selektion nach der Transformation

Insekten-Zellen

pLSG-IBA-Vektoren

Expression von rekombinanten Proteinen in Insektenzellen
Polyhedrin-Promotor steuert die Expression des Inserts und sorgt für eine hochgradige Expression
Ampicillin-Resistenzkassette zur Selektion von transformierten E. coli-Zellen
ColEl origin für eine hohe Plasmid-Kopiezahl in E. coli

Mammalia-Zellen

pDSG-IBA-Vektoren

Optimiert für MEXi, das Mammalia- Expression-System von IBA Lifesciences, und auch für andere Säugetierzellkulturen geeignet
Konstitutive Expression auf hohem Niveau in Säugetierzellen durch den CMV-Promotor
Extrachromosomale Replikation durch den Epstein-Barr-Virus-Replikationsursprung (oriP)
erfordert chromosomale Expression des EBNA-1-Gens, z. B. wie in MEXi 293E-Zellen
Ampicillin-Resistenzkassette zur Selektion von transformierten E. coli-Zellen
ColEl origin für eine hohe Plasmid-Kopiezahl in E. coli
Option für die Sekretion des Zielproteins in das Zellkulturmedium über das BM40-Sekretions-Signal-Peptid

pESG-IBA-Vektoren

Konstitutive Expression auf hohem Niveau in Säugetierzellen durch den CMV-Promotor
Neomycin-Resistenz zur Erzeugung stabiler Zelllinien
Ampicillin-Resistenzkassette zur Selektion von transformierten E. coli-Zellen
ColEl origin für eine hohe Plasmid-Kopiezahl in E. coli
Option für die Sekretion des Zielproteins in das Zellkulturmedium über das BM40-Sekretions-Signal-Peptid

pCSG-IBA-Vektoren

Konstitutive Expression auf hohem Niveau in Säugetierzellen durch den CMV-Promotor
extrachromosomale Replikation durch den Epstein-Barr-Virus-Replikationsursprung (oriP)
keine chromosomale Expression des EBNA-1-Gens erforderlich, da es auf dem Vektor kodiert ist
lang anhaltende Proteinexpression unter G418-Selektion, ohne dass stabile Zelllinien hergestellt werden müssen
Ampicillin-Resistenzkassette zur Selektion von transformierten E. coli-Zellen
ColEl origin für eine hohe Plasmid-Kopiezahl in E. coli
Option für die Sekretion des Zielproteins in das Zellkulturmedium über das BM40-Sekretions-Signal-Peptid

Expression in E. coli - gut zu wissen!

Bildung von Disulfidbrücken

Proteine, die unter natürlichen Bedingungen sezerniert werden, enthalten häufig Disulfidbrücken. Die reduzierenden Bedingungen im Zytoplasma von E. coli verhindern jedoch die Bildung von Disulfidbrücken, wodurch diese Proteine häufig aggregieren und abgebaut werden. Um die Aggregation und den Abbau zu verhindern, ist eine Sekretion in periplasmatischen Raum von E. coli empfehlenswert. Einige Vektoren bieten eine N-terminale Fusion des ompA-Signalpeptids, das die Sekretion des rekombinanten Proteins in den periplasmatischen Raum von E. coli vermittelt. Dort wird das Signalpeptid selektiv von der E. coli-Signalpeptidase gespalten und ein funktionales Protein kann entstehen.

Periplasmatische Sekretion als erster Reinigungsschritt

Darüber hinaus trennt die periplasmatische Sekretion das rekombinante Protein von zytosolischen Proteasen. Da die äußere Membran von E. coli durch milde Behandlung (EDTA, Lysozym usw.) selektiv abgebaut werden kann, lassen sich die Sphäroplasten, die die zytosolischen Bestandteile enthalten, durch Zentrifugation leicht entfernen.

Zugabe von Wirkstoffen

Darüber hinaus ist der periplasmatische Raum für Moleküle < 600 Da zugänglich, so dass die Faltung oder Stabilität des rekombinanten Proteins während der Expression durch Zugabe aktiver Substanzen in das Kulturmedium (z. B. Redoxkomponenten, nicht metabolisierbare Zucker, Liganden des rekombinanten Proteins) beeinflusst werden kann .

Zytoplasmatische oder periplasmatische Expression

Solange ein zytoplasmatisches rekombinantes Protein keine Stop-Transfer-Sequenzen enthält, sind die Vorteile der periplasmatischen Sekretion auch für diese Art von Protein nutzbar. Da Stop-Transfer-Sequenzen jedoch schwer vorhersagbar sind, ist es ratsam, beide Strategien parallel zu erproben.

Tet-Expressionssystem

Merkmale und Vorteile der pASK-IBA-Vektoren:

Hochgradige Expression in E. coli auch für zytotoxische Proteine
Streng regulierte Expression durch den Tetracyclin-Promotor
Kostengünstige Induktion mit Anhydrotetracyclin

Die pASK-IBA-Vektoren sind mit Strep-tag®II, dem OmpA-Sekretionssignal, speziellen Proteaseschnittstellen und Chloramphenicol-Resistenz erhältlich.

Prinzip und Eigenschaften

pASK-IBA-Vektoren enthalten den streng regulierten Tetracyclin (tetA)-Promotor, der bis zur Induktion mit einer niedrigen Konzentration an Anhydrotetracyclin durch den tet-Repressor unterdrückt wird. Eine vorzeitige Expression des fremden Gens bleibt dadurch aus. Der tet-Repressor ist ebenfalls auf dem pASK-IBA-Vektoren kodiert und wird konstitutiv vom Chloramphenicol-Acetyltransferase-Promotor exprimiert. Die Vektoren vermitteln aber keine Resistenz gegen Tetracyclin.

Anders als beim T7-Promotor sind keine speziellen E. coli-Stämme oder zusätzliche Plasmide erforderlich. Im Gegensatz zum lac-Promotor liegt beim tetA-Promotor/Operator keine vorzeitige Expression ohne Induktionsmittel vor und ist funktionell nicht an zelluläre Regulationsmechanismen oder einen bestimmten genetischen Hintergrund gekoppelt. Des Weitere ist der tetA-Promotor im Vergleich zum lac-Promotor auch nicht anfällig für Katabolitrepression (cAMP-Spiegel, Stoffwechselzustand), wird nicht von chromosomal kodierten Repressormolekülen beeinflusst.

Infolgedessen sind keine speziellen E. coli-Stämme oder zusätzliche Plasmide erforderlich, und es kann eine breite Palette von Kulturmedien und -bedingungen verwendet werden. So können beispielsweise Glukose-Minimalmedien und sogar der Bakterienstamm XL1-Blue, der eine episomale Kopie des Tetracyclin-Resistenzgens trägt, zur Expression verwendet werden. Das pASK-IBA-Expressionssystem ist unter vielen Bedingungen, einschließlich Fermentation, stabil und einfach zu handhaben.

Weitere Elemente der Vektoren sind eine Tandem-Ribosomenbindungsstelle (RBS), die eine effiziente Initiierung der Translation gewährleistet, der starke Terminator des Lipoprotein-Gens, um ein Durchlesen zu verhindern, die intergene Region des Bakteriophagen f1, die eine Möglichkeit zur Herstellung von ssDNA bietet, sowie ein Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen.

Referenz: Skerra, A. (1994). Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli. Gene, 151, 131-135.

Die folgenden E. coli-Stämme wurden bereits erfolgreich für die Tet-Expression mit unseren pASK-IBA-Vektoren verwendet:

JM83
WK6
B
BL21
MG1655
W3110
BL21(DE3)
BLR(DE3)
XL1-Blue
BL21-CodonPlusTM-RIL

Für die Sekretion empfehlen wir JM83. Für die zytoplasmatische Expression werden E. coli B-Stämme empfohlen, da ihnen die lon-Protease und die ompT-Protease der äußeren Membran fehlen, die Proteine abbauen können (Grodberg und Dunn, 1988, J.Bacteriol. 170, 1245).

Bisher ist uns kein E. coli-Stamm bekannt, der mit dem Tet-Expressionssystem inkompatibel ist.

Anhydrotetracyclin: Induktor für den tetA-Promotor

Die Expressionskassette der PASK-Vektoren steht unter der Transkriptionskontrolle des tetA-Promotors/Operators und Repressors. Der Promotor wird durch eine niedrige Konzentration von Anhydrotetracyclin (AHT) induziert, was Kosten spart und die antibakterielle Wirkung von AHT minimiert. Degenkolb et al. (1991) haben gezeigt, dass AHT 35-mal fester als Tetracyclin an den tet-Repressor bindet.

TypIIS-Restriktionsenzyme

Typ-II-Enzyme sind eine der vier (I-IV) Arten von anerkannten Endonukleasen, die DNA an einer bestimmten Erkennungsstelle schneiden. Typ-II-Enzyme schneiden innerhalb oder in geringer Entfernung von ihren Erkennungsstellen, die in der Regel 4-8 Nukleotide lang sind.

Zu ihnen gehören die Enzyme vom Typ IIS, wie LguI und Esp3I.

Restriktionsenzyme vom Typ IIS sind dimere Enzyme, die DNA in einem bestimmten Abstand von ihrer nicht-palindromischen, asymmetrischen Erkennungsstelle spalten. Dies bedeutet, dass die Zielsequenz nur in einer Richtung gelesen werden kann. Dadurch kann der Verdau mit nur einem einzigen Enzym zwei verschiedene unabhängige klebrige Enden mit 5'-Überhängen erzeugen, die eine gerichtete Klonierung ermöglichen. Außerdem wird nach der Verdauungsreaktion die Erkennungssequenz vollständig entfernt, so dass die kodierte Aminosäuresequenz durch die verbleibenden Restriktionsenzymstellen nicht beeinträchtigt wird.

Type IIS enzymes LguI and Esp3I restriction enzymes

Die Verwendung von Restriktionsenzymen vom TypIIS bietet wichtige Funktionen für die Klonierung:

Sie ermöglicht das Klonieren in einem Reaktionsgefäß
Die exprimierten Proteine enthalten keine zusätzlichen Aminosäuren
Die Klonierung erfolgt immer im gleichen Leserahmen der weiteren Vektoreigenschaften
Der Zusammenbau mehrerer Fragmente ist möglich

Referenzen: Pingoud A, Jeltsch A (2001). Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29 (18): 3705–27.

Anwendungsbeispiel

StarGate umfasst Vektoren zur Expression in Säugetierzellen (pCSG-IBA, pESG-IBA, pDSG-IBA), Hefe (pYSG-IBA), E. coli (pASG-IBA) und Insektenzellen (pLSG-IBA). Als Beispiel wurde das bakterielle Protein Azurin in verschiedene pASG-IBA-Vektoren kloniert und in E. coli exprimiert. Die Expressionsergebnisse wurden mittels SDS-PAGE analysiert.

Die kodierende Sequenz von Azurin, einem 14-kDa-großen bakteriellen Protein, wurde in 9 verschiedene pASG-IBA-Vektoren kloniert und in E. coli exprimiert. Vergleichbare Mengen von E. coli-Zellen wurden 3 Stunden nach der Induktion mit Anhydrotetracyclin geerntet. Die Proben wurden durch 5-minütiges Kochen bei 95 °C mit Gelladepuffer lysiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Anschließend wurde das Gel mit Coomassie angefärbt. Die periplasmatische Sekretion mittels ompA führte in allen Fällen zur Anreicherung vergleichbarer Mengen des Zielproteins (Spuren 6-9). Dies war zu erwarten, da Azurin auch unter natürlichen Bedingungen in P. aeruginosa sezerniert wird. Im Falle der zytosolischen Expression zeigten sich jedoch überraschend, dass eine zytosolische Expression von Azurin überhaupt möglich ist. Die Expression wurde durch die Fusion eines N-terminalen Affinitäts-Tags ermöglicht (Spur 2, 4 und 5), während N-terminal nicht getaggte Varianten zu keiner Expression führten (Spur 1 und 3). Das Beispiel zeigt, dass sich ein anfängliches Screening der Expressionsbedingungen lohnen kann, da verschiedene Konstrukte je nach den Eigenschaften des Zielproteins zu unterschiedlichen Ergebnissen führen können.